Degradačné schopnosti mikroorganizmov v bioremediačných technológiách -II

Medzi základné možnosti zvyšovania intenzity degradácie kontaminantov mikroorganizmami patrí biostimulácia prirodzenej pôdnej mikroflóry (o kterej sme hovorili v prvej časti článku) a bioaugmentácia.

Inokulácia mikroorganizmov

Inokulácia mikroorganizmov do pôdy (angl. bioaugmentation) je metóda bioremediačnej technológie, pri ktorej je prostredie obohacované mikroorganizmami za účelom urýchlenia biodegradačných procesov vedúcich k detoxikácii, prípadne k úplnému odstráneniu kontaminujúcich látok.

Jedná sa najčastejšie o zmesné kultúry mikroorganizmov, ale aj čisté kmene adaptované v laboratóriu na cielený kontaminant. Spravidla sú kultivované v laboratórnych bioreaktoroch, lyofilizované a priamo aplikované na lokalitu, alebo do biologických reaktorov a biofiltrov. Ako inokulum môžu byť použité baktérie, huby, ale aj enzýmy, aktívna pôda (humus) a aktivovaný kal.

Schopnosť mikroorganizmov metabolizovať danú látku je síce nevyhnutná, nie však postačujúca podmienka pre jej účinné odstránenie z nesterilného prostredia. Selekcia mikroorganizmov by sa mala byť zameraná v prvom rade na schopnosť prežiť v danom prostredí, a až sekundárne na jeho degradačné schopnosti. Mikroorganizmus by sa mal izolovať pri nízkej koncentrácii substrátu a anorganických živín. Takto získaný kmeň by mohol mať väčšiu šancu na úspech ako mikroorganizmus so síce ve3/4kou degradačnou schopnosťou, no neschopný prispôsobiť sa náročným podmienkam v pôde.

Inokulovaný mikroorganizmus musí byť schopný súťažiť s prirodzenou mikroflórou o živiny. Pri aplikácii ve3/4kého množstva biomasy bude časť buniek pravdepodobne lyzovať, čím sa uvo3/4ní značné množstvo 3/4ahko využitelného zdroja uhlíka, čo len zvýši konkurenčný boj o živiny. Mikroorganizmus, ktorý by dokázal absorbovať špecifické živiny do svojej bunkovej steny ešte pred inokuláciou, by bol pravdepodobne zvýhodnený.

Problém toxických intermediátov, ktoré sú produkované čistými kultúrami, by mohol byť čiastočne eliminovaný použitím zmesných kultúr so širokým spektrom metabolických vlastností.

Procesy zvyšujúce účinnosť

V mikrobiálnych komunitách sa vyskytujú mnohé procesy, ktoré zvyšujú účinnosť mikrobiálneho metabolizmu. Patrí medzi ne produkcia rastových faktorov, odstraňovanie toxických medziproduktov a kometabolizmus.

Inokulácia sa najčastejšie aplikuje, ak sa mikroorganizmy so schopnosťou rozkladať daný kontaminant v konkrétnom prostredí nevyskytujú, alebo sa vyskytujú v nedostatočnom počte. Nevyhnutnými podmienkami úspešnej inokulácie je ich prežitie, kolonizácia v danom prostredí, prípadne ich pomnoženie, súťaženie s prirodzenou pôdnou mikroflórou, expresia génov kódujúcich degradačné enzýmy, udržanie si degradačnej aktivity a transport inokulovaných mikroorganizmov na kontaminované miesto, teda bioprístupnosť kontaminantu. Aj keď vnesený mikroorganizmus mnohokrát dostatočne dlhú dobu neprežije, nedokáže sa kolonizovať, môže byť potenciálne donorom rozkladnej genetickej informácie pre natívnu mikroflóru. Pokia3/4 nie sú splnené vyššie uvedené predpoklady, je použitie bioaugmentácie neopodstatnené a bioaugmentácia je neúčinná.

Pravdepodobné príčiny neúspešnosti inokulácie mikroorganizmov do pôd možno zosumarizovať nasledovne:

koncentrácia polutantov v prírode môže byť nato3/4ko nízka, že nestačí na rast inokulovaného kmeňa,

prirodzené prostredie môže obsahovať látky s antibakteriálnymi účinkami, ktoré inhibujú rast a/alebo aktivitu pridávaného mikroorganizmu,

rastová rýchlosť mikroorganizmu pri nízkych koncentráciách skúmanej látky môže byť nižšia ako rastová rýchlosť jeho prirodzených konkurentov,

pridávané mikroorganizmy môžu využívať prednostne organické substráty nachádzajúce sa v pôde na úkor rozkladu polutantu,

mikroorganizmy môžu mať problémy s pohybom cez pôdne póry do miest obsahujúcich polutant.

Čo môžeme očakávať

Hoci sa biologické metódy využívajú v remediáciách a na spracovanie nebezpečných odpadov viac ako 10 rokov, je ešte stále veĺa tých, ktorí ich spochybňujú a veĺa tých, ktorí ich preceňujú. Mnohí vyjadrujú pochybnosti o potenciále bioremediácie pre čistiace projekty, ďalší neveria, že je cenovo efektívna, iní si myslia, že je tak jednoduchá, že akákoĺvek firma dokáže technológiu aplikovať na daný projekt.

Kde je pravda? Čo môžeme rozumne očakávať od tejto technológie? Bioaugmentácia sa javí ako perspektívna, ale v súčasnosti ešte stále mierne kontroverzná a nie dostatočne overená technológia pre remediáciu kontaminovaných pôd. Od roku 1985 sa úspešne testuje využitie bioaugmentácie pre opracovanie pôd s obsahom ťažkorozložiteĺných zlúčenín ako sú alachlor, atrazin, 2,4-dichlórfenoxy-octová kyselina, tetrachlórmetán, polycyklické aromatické uhĺovodíky, pentachlórfenol a trichlóretylén.

Je však opísaných aj viacero prípadov, v ktorých bioaugmentácia nebola efektívna. Dôvodmi pre tieto neúspechy bola limitácia živín, prítomnosť predátorov mikroorganizmov, slabý transport baktérií v pôde a nízke koncentrácie substrátov, ktoré prispievali k slabému prežívaniu a nízkej aktivite inokula. Po úvodnom optimizme sa v mnohých laboratórnych i poloprevádzkových štúdiách ukázalo, že inokulovaný biopreparát na miesto kontaminácie mnohokrát vôbec nedorazí alebo neprežije v súťaži s prirodzenými spoločenstvami a pôdnymi predátormi.

Je zrejmé, že pre mnohé kontaminanty, predovšetkým zo skupiny alifatických uhĺovodíkov, sú na väčšine lokalít už prítomné baktérie s degradačnou schopnosťou a ich dodávanie do prostredia vo forme biopreparátov nie je nutné. O možnom použití bioaugmentácie sa preto hovorí skôr v spojitosti s perzistentnými xenobiotickými zlúčeninami, akými sú polychlórované etylény, polychlórované bifenyly, chlórované dioxíny, organofosfátové pesticídy, než v súvislosti s alifatickými ropnými uhĺvodíkmi.

Jednou zo stratégií pre zvýšenie účinnosti bioaugmentácie je opakovaná aplikácia aktívneho inokula. Tento postup rieši problém s dlhodobým prežívaním inokulovaných buniek, môže pomôcť zaistiť vyššiu aktivitu degradujúcich baktérií, môže zvýšiť pravdepodobnosť ich transportu a pomôcť zaistiť ich distribúciu v pôdnom profile.

Legislatíva

Problémom ostáva aj legislatíva použitia týchto mikroorganizmov v in situ podmienkach. V prípade použitia geneticky konštruovaných mikroorganizmov je potrebné uvažovať s nasledovnými limitáciami: životnosť, produkčná cena a environmentálna bezpečnosť.

Faktory ovplyvňujúce biodegradáciu

Väčšina doposiaĺ uvádzaných poznatkov o aeróbnej degradácii hydrofóbnych polutantov bola získaná v kvapalných médiách za laboratórnych podmienok. Reálne sa však tieto kontaminanty vďaka svojim fyzikálno-chemickým vlastnostiam nachádzajú vo vode len vo veĺmi nízkych koncentráciách. Kĺúčovým problémom v praxi teda nebude iba dekontaminácia vodných systémov, ktoré sú zväčša kontaminované až sekundárne, ale hlavne dekontaminácia primárneho zdroja znečistenia, a tým je vo väčšine prípadov kontaminovaná pôda.

A tu, pri prenose laboratórne pripravených mikroorganizmov do reálneho pôdneho ekosystému vznikajú nové problémy. Vo všeobecnosti je možné povedať, že účinnosť selektovaných mikroorganizmov aplikovaných do pôdy je podstatne nižšia ako v kvapalných médiách. V porovnaní s kvapalnými médiami je pôda extrémne zložitá matrica. Fyzikálne, chemické a biologické vlastnosti pôdy musia byť na nelimitujúcej úrovni, aby sa mohla účinnosť bioremediácie prejaviť. Limitácia ktoréhoko3/4vek komponentu z týchto troch vlastností môže byť dostatočná na zabrzdenie všetkých potenciálnych remediačných aktivít.

Degradačná rýchlosť závisí od kinetických parametrov inokulovaného kmeňa, ktoré môžu byť ovplyvňované environmentálnymi faktormi (pôdne pH, kyslíkové pomery, množstvo a kvalita živín, vlhkosť pôdy), ale aj mikrobiálnymi faktormi (kvalita a množstvo prirodzenej pôdnej mikroflóry a inokulovaného kmeňa).

V prípade tak extrémne hydrofóbnych látok, akými sú napr. PCB, hrá nemenej dôležitú úlohu aj ich prístupnosť pre mikroorganizmy, tzv. bioprístupnosť. Bioprístupnosť je úzko spájaná so sorpciou, ktorá závisí od kvality a kvantity organickej hmoty v pôde a tým varíruje s typom pôd, teda závisí aj od fyzikálno-chemických vlastností.

Väčšina autorov sa domnieva, že iba tá časť chemikálie, ktorá sa nachádza v roztoku, je priamo prístupná pre mikroorganizmy a tak sorpcia degradáciu spomaĺuje. Existujú však práce, ktoré uvádzajú opačný trend a to pozitívnu koreláciu medzi degradáciou a sorpciou. Tento jav je interpretovaný tak, že ak dôjde k pasívnej, či aktívnej sorpcii bunky na miesto, kde sa nachádza polutant, rýchlosť degradácie sa v dôsledku prekoncentračného efektu môže zvýšiť.

Aby bolo možné úspešne odhadnúť a čiastočne aj ovplyvniť potenciál rozkladu kontaminantov v pôde, je potrebné dôkladne poznať ich chemické a fyzikálno-chemické vlastnosti. Keďže hydrofóbnosť je dominantná vlastnosť mnohých chlóraromátov, ich osud v pôde významne ovplyvňujú predovšetkým sorpčné javy. Sorpčná kapacita pôdy výrazne ovplyvňuje sorpciu takýchto neiónových hydrofóbnych polutantov a je výrazne závislá od pH, množstva a kvality pôdnej organickej hmoty, obsahu organického uhlíka, ale zároveň aj od jej zloženia a chemickej štruktúry, predovšetkým humínových kyselín.

Zloženie a chemickú štruktúru humínového materiálu je potrebné brať do úvahy pri modelovaní transportu a osudu hydrofóbnych chemikálií v pôdach.

Snáď najdôležitejšia vlastnosť látok z hĺadiska ich osudu v životnom prostredí je ich rozpustnosť vo vode, pretože na základe tejto hodnoty sa posudzuje ich pohyblivosť, stabilita, rozklad, akumulácia, bioakumulácia, či sorpcia. Ďalšia dôležitá vlastnosť je rozdeĺovací koeficient n-oktanol/voda, ktorý indikuje bioakumuláciu a biokoncentráciu chemikálií, ako adsorpčný koeficient, ktorý vyjadruje tendenciu zlúčeniny nachádzať sa v pôdnom prostredí vo vodnej alebo pevnej fáze.

Nemenej dôležitou vlastnosťou je polčas rozpadu, ktorý závisí od podmienok, za akých sa látka v pôde nachádza. Pohyblivosť a biologická prístupnosť chemikálií v pôde je v priamom vzťahu k stupňu väzby alebo sorpcie na organické i anorganické pôdne komponenty.

Avšak interakcia chlóraromátov s pôdnou organickou hmotou môže byť charakterizovaná aj ako alternatívna metóda odstránenia organických kontaminantov zo životného prostredia. Podtrieda fenolových oxidáz, známych ako lakázy, je schopná zabudovávať xenobiotiká do štruktúry humínových zlúčenín prítomných v pôde.

Anaeróbne procesy v pôdach

Ako už bolo uvedené v predchádzajúcom, anaeróbna reduktívna dehalogenácia môže pozitívne ovplyvniť konečnú degradáciu hydrofóbnych kontaminantov. Anaeróbne procesy v pôdach nie sú zriedkavým javom a za určitých podmienok, hlavne vo vysoko zavodnených pôdach, dominujú nad procesmi aeróbnymi. Anaerobióza sa v pôdach objavuje v prípade, že rýchlosť spotreby kyslíka je väčšia než jeho prísun. Závisí primárne od množstva využiteĺného uhlíka pre respiráciu, teploty, vlhkosti pôdy a jej fyzikálnych charakteristík, hlavne pórozity, ktorá je ovplyvnená pôdnou štruktúrou a textúrou.

Mikroorganizmy schopné existovať v pôde za anaeróbnych podmienok tvoria až desať percent populácie, ich najpočetnejšou skupinou sú klostrídiá. Z pozorovania viacerých autorov vyplýva, že v pôde môže dochádzať za podmienok nízkeho redoxného potenciálu aj k abiotickým reduktívnym procesom. V úvahách o látkach, ktoré sú zodpovedné za abiotickú redukciu polutantov, sa najčastejšie spomína železitý ión, alebo jeho komplexy. Vo všeobecnosti pomerne silným redukujúcim faktorom v pôde môže byť prirodzená organická matrica a z nej hlavne hydrochinóny, ako aj mnoho ďalších látok, medzi inými napr. vitamín B12.

Staré záťaže pretrvávajú

Čo sa týka znečistenia jednotlivých zložiek životného prostredia Slovenska, pretrvávajú staré záťaže, pričom jednotlivé regióny majú svoje špecifiká. Riešenie pretrvávajúcich environmentálnych problémov je vlastne riešenie problémov ekonomických. Prebiehajúci proces aproximácie európskej environmentálnej legislatívy vymedzuje však podstatne vyššie požiadavky na kvalitu jednotlivých zložiek životného prostredia. Vytvára sa tým priestor pre vývoj nových aj bioremediačných a iných technológií a rozvoj výskumných aktivít. Aproximácia európskej environmentálnej legislatívy by pritom mala byť garantom toho, že sa k nám nedostanú zo zahraničia zastaralé technológie, ktoré by mohli ekologickú zadÍženosť ešte zvýšiť.

Katarína Dercová,

katedra biochemickej technológie,

Slovenská technická univerzita,

Bratislava

(Práce vznikla s podporou grantu VEGA č. 1/9131/02, plné znění včetně odkazů je k dispozici v redakci)